Дитиотреитол (ДТТ) е најчесто користено средство за намалување, познато и како нов зелен додаток.Тоа е мало молекуларно органско соединение со две групи меркаптан (-SH).Поради своите намалувачки својства и стабилност, ДТТ е широко користен во биохемиските и молекуларните биолошки експерименти.
Главната улога на ДТТ е да ги намали дисулфидните врски во протеините и другите биомолекули.Дисулфидната врска е важен дел од склопувањето и стабилноста на протеините, но под одредени експериментални услови, како што се редуцирана SDS-PAGE анализа, рекомбинација на протеини и преклопување, неопходно е да се намали дисулфидната врска на две тиол групи за да се разоткрие просторната структура на протеинот.ДТТ може да реагира со дисулфидни врски за да ги намали во групи на меркаптан, со што се отвора просторната структура на протеинот и се олеснува анализата и манипулацијата.
DTT може да се користи и за заштита на ензимската активност и стабилност.Во некои ензимски катализирани реакции, активноста на ензимот може да се намали од оксидантот.ДТТ може да реагира со оксиданти за да ги сведе на безопасни материи, а со тоа да ја заштити активноста и стабилноста на ензимот.
Во споредба со традиционалните редуцирачки агенси како што е β-меркаптоетанолот (β-ME), ДТТ се смета за побезбедно и постабилно средство за намалување.Не само што е стабилен во воден раствор, туку и ги одржува своите намалувачки својства при високи температури и киселинско-базни услови.
Употребата на DTT е релативно едноставна.Генерално, ДТТ се раствора во соодветен тампон и потоа се додава во експерименталниот систем.Оптималната концентрација на ДТТ треба да се одреди според конкретниот експеримент и генерално се користи во опсег од 0,1-1 mM.Пониските концентрации може да ги намалат негативните ефекти врз клеточниот раст и може да ја намалат цитотоксичноста поради прекумерна експресија на целните протеини.Повисоките концентрации може да предизвикаат прекумерно клеточно метаболичко оптоварување, што влијае на клеточниот раст и ефикасноста на експресијата.
Начинот на одредување на оптималната концентрација може да биде да се оцени нивото на изразување на целниот протеин со спроведување на тестови за индукција на IPTG во различни концентрации.Тестовите за култура во мали размери може да се изведат со користење на опсег на концентрации на IPTG (на пр. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, итн.) и ефектот на изразување во различни концентрации може да се оцени со откривање на нивото на изразување на целниот протеин (на пр. Western откривање на размачкана или флуоресценција).Според експерименталните резултати, концентрацијата со најдобар изразен ефект е избрана како оптимална концентрација.
Дополнително, може да се повикате и на релевантната литература или на искуството од други лаборатории за да го разберете вообичаено користениот опсег на концентрација на IPTG под слични експериментални услови, а потоа да го оптимизирате и прилагодите според експерименталните потреби.
Важно е да се напомене дека оптималната концентрација може да варира во зависност од различните системи на изразување, целните протеини и експерименталните услови, па затоа е најдобро да се оптимизира од случај до случај.
Накратко, ДТТ е најчесто користен редукционен агенс што може да се користи за намалување на дисулфидните врски во протеините и другите биомолекули и за заштита на ензимската активност и стабилност.Широко се користи во биохемиските и молекуларните биолошки експерименти.
Време на објавување: 28-ти септември 2023 година