Дитиотреитолот (DTT) е често користен редукционен агенс, познат и како нов зелен адитив. Тој е мало молекуларно органско соединение со две меркаптански групи (-SH). Поради своите редукциони својства и стабилност, DTT е широко користен во експериментите по биохемија и молекуларна биологија.
Главната улога на DTT е да ги намали дисулфидните врски во протеините и другите биомолекули. Дисулфидната врска е важен дел од склопувањето и стабилноста на протеините, но под одредени експериментални услови, како што се редуцибилна SDS-PAGE анализа, рекомбинација и склопување на протеини, потребно е дисулфидната врска да се редуцира на две тиол групи за да се разоткрие просторната структура на протеинот. DTT може да реагира со дисулфидни врски за да ги редуцира на меркаптански групи, со што се отвора просторната структура на протеинот и се олеснува анализата и манипулацијата.
DTT може да се користи и за заштита на ензимската активност и стабилност. Во некои реакции катализирани од ензими, активноста на ензимот може да биде намалена од оксидантот. DTT може да реагира со оксиданти за да ги редуцира до безопасни супстанции, со што се заштитува активноста и стабилноста на ензимот.
Во споредба со традиционалните редукциски агенси како што е β-меркаптоетанол (β-ME), DTT се смета за побезбеден и постабилен редукциски агенс. Тој не само што е стабилен во воден раствор, туку ги задржува и своите редукциски својства на висока температура и кисело-базни услови.
Употребата на DTT е релативно едноставна. Генерално, DTT се раствора во соодветен пуфер, а потоа се додава во експерименталниот систем. Оптималната концентрација на DTT треба да се одреди според специфичниот експеримент и генерално се користи во опсег од 0,1-1 mM. Пониските концентрации можат да ги намалат негативните ефекти врз растот на клетките и да ја намалат цитотоксичноста поради прекумерна експресија на целните протеини. Повисоките концентрации може да предизвикаат прекумерно метаболичко оптоварување на клетките, влијаејќи на растот на клетките и ефикасноста на експресијата.
Начинот за одредување на оптималната концентрација може да биде проценка на нивото на експресија на целниот протеин со спроведување на IPTG индукциски тестови при различни концентрации. Тестовите за мали култури може да се извршат со користење на опсег на IPTG концентрации (на пр. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, итн.) и ефектот на експресија при различни концентрации може да се оцени со откривање на нивото на експресија на целниот протеин (на пр. Western blot или флуоресцентна детекција). Според експерименталните резултати, концентрацијата со најдобар ефект на експресија е избрана како оптимална концентрација.
Покрај тоа, можете да се повикате и на релевантната литература или на искуството на други лаборатории за да го разберете најчесто користениот опсег на концентрација на IPTG под слични експериментални услови, а потоа да го оптимизирате и прилагодите според експерименталните потреби.
Важно е да се напомене дека оптималната концентрација може да варира во зависност од различните системи на експресија, целните протеини и експерименталните услови, па затоа е најдобро да се оптимизира за секој случај посебно.
Накратко, DTT е често користен редукционен агенс кој може да се користи за намалување на дисулфидните врски во протеините и другите биомолекули и за заштита на ензимската активност и стабилност. Широко се користи во експериментите по биохемија и молекуларна биологија.
Време на објавување: 28 септември 2023 година