IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) е аналог на супстратот на β-галактозидаза, кој е многу индуциран.Под индукција на IPTG, индукторот може да формира комплекс со протеинот на репресорот, така што конформацијата на протеинот на репресорот се менува, така што тој не може да се комбинира со целниот ген, а целниот ген се изразува ефикасно.Значи, како треба да се одреди концентрацијата на IPTG за време на експериментот?Дали колку е поголемо, толку подобро?
Прво, да го разбереме принципот на индукција на IPTG: лактозен оперон (елемент) на E. coli содржи три структурни гени, Z,Y и A, коишто кодираат β-галактозидаза, пермеаза и ацетилтрансфераза, соодветно.lacZ ја хидролизира лактозата во гликоза и галактоза, или во ало-лактоза;lacY овозможува лактозата во околината да помине низ клеточната мембрана и да влезе во клетката;lacA ја пренесува ацетил групата од ацетил-CoA на β-галактозид, што вклучува отстранување на токсичниот ефект.Дополнително, постои оперативна секвенца О, почетна секвенца P и регулаторен ген I. Кодот на генот I е репресорски протеин кој може да се поврзе со позицијата О на операторската секвенца, така што оперонот (мета) е потиснат и исклучено.Исто така, постои место за врзување за местото на врзување протеин-CAP на активатор на катаболичен ген горе од иницијативната секвенца P. P секвенцата, O секвенцата и местото за врзување CAP заедно го сочинуваат регулаторниот регион на lac оперонот.Кодирачките гени на трите ензими се регулирани од истиот регулаторен регион за да се постигне координирана експресија на генските производи.
Во отсуство на лактоза, лак-оперонот (мета) е во состојба на репресија.Во тоа време, lac репресорот изразен од секвенцата I под контрола на промоторската секвенца PI се врзува за O секвенцата, што спречува РНК полимеразата да се врзе за P секвенцата и го инхибира започнувањето на транскрипцијата;кога е присутна лактоза, може да се индуцира лак-оперонот (мета) Во овој оперон (мета) систем, вистинскиот индуктор не е самата лактоза.Лактозата влегува во клетката и се катализира од β-галактозидаза за да се претвори во алолактоза.Вториот, како индуктор на молекула, се врзува за репресорскиот протеин и ја менува конформацијата на протеините, што доведува до дисоцијација на репресорниот протеин од секвенцата О и транскрипција.Изопропилтиогалактозидот (IPTG) го има истиот ефект како алолактозата.Тој е многу моќен индуктор, кој не се метаболизира од бактерии и е многу стабилен, па затоа е широко користен во лабораториите.
Како да се одреди оптималната концентрација на IPTG?Земете E. coli како пример.
Е. coli BL21 генетски конструиран сој кој го содржи позитивниот рекомбинантен pGEX (CGRP/msCT) беше инокулиран во LB течен медиум кој содржи 50 μg·mL-1 Amp и се култивираше преку ноќ на 37°C.Горенаведената култура беше инокулирана во 10 шишиња од 50 mL свеж LB течен медиум кој содржи 50 μg·mL-1 Amp во сооднос 1:100 за култура на експанзија, и кога вредноста на OD600 беше 0,6-0,8, IPTG беше додаден на конечната концентрација.Тоа е 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.По индукцијата на иста температура и во исто време, од него е земен 1 mL од бактерискиот раствор, а бактериските клетки се собрани со центрифугирање и се подложени на SDS-PAGE за да се анализира влијанието на различни концентрации на IPTG врз експресијата на протеините, а потоа изберете ја концентрацијата на IPTG со најголема протеинска експресија.
По експериментите, ќе се открие дека концентрацијата на IPTG не е колку што е можно поголема.Тоа е затоа што IPTG има одредена токсичност за бактериите.Надминувањето на концентрацијата исто така ќе ја убие клетката;и општо земено, се надеваме дека колку повеќе растворлив протеин е изразен во клетката, толку подобро, но во многу случаи кога концентрацијата на IPTG е превисока, ќе се формира голема количина на инклузија.Тело, но количината на растворливи протеини се намали.Затоа, најсоодветната концентрација на IPTG често не е колку поголема, толку подобро, туку колку е помала концентрацијата.
Целта на индукцијата и одгледувањето на генетски инженерските соеви е да се зголеми приносот на целниот протеин и да се намалат трошоците.На експресијата на целниот ген не влијаат само сопствените фактори на сојот и плазмидот на експресија, туку и други надворешни услови, како што се концентрацијата на индукторот, температурата на индукција и времето на индукција.Затоа, генерално, пред да се изрази и прочисти непознат протеин, најдобро е да се проучат времето на индукција, температурата и концентрацијата на IPTG со цел да се изберат соодветни услови и да се добијат најдобри експериментални резултати.
Време на објавување: 31-12-2021 година