IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид) е аналог на β-галактозидазниот супстрат, кој е високо индуцибилен. Под индукција на IPTG, индуктор може да формира комплекс со репресорскиот протеин, така што конформацијата на репресорскиот протеин се менува, така што не може да се комбинира со целниот ген, а целниот ген се експресира ефикасно. Па, како треба да се одреди концентрацијата на IPTG за време на експериментот? Дали колку е поголем, толку е подобар?
Прво, да го разбереме принципот на IPTG индукција: лактозниот оперон (елемент) на E. coli содржи три структурни гени, Z, Y и A, кои кодираат β-галактозидаза, пермеаза и ацетилтрансфераза, соодветно. lacZ ја хидролизира лактозата во гликоза и галактоза, или во ало-лактоза; lacY дозволува лактозата во околината да помине низ клеточната мембрана и да влезе во клетката; lacA ја пренесува ацетилната група од ацетил-CoA во β-галактозид, што вклучува отстранување на токсичен ефект. Покрај тоа, постои оперативна секвенца O, почетна секвенца P и регулаторен ген I. Кодот на генот I е репресорски протеин кој може да се врзе за позицијата O од операторската секвенца, така што оперонот (мета) е потиснат и исклучен. Исто така, постои место за врзување за местото на врзување на катаболниот ген активаторски протеин-CAP пред иницијалната секвенца P. P секвенцата, O секвенцата и CAP местото за врзување заедно го сочинуваат регулаторниот регион на lac оперонот. Кодирачките гени на трите ензими се регулирани од истиот регулаторен регион за да се постигне координирана експресија на генските производи.
Во отсуство на лактоза, lac оперонот (мета) е во состојба на репресија. Во овој момент, lac репресорот експресиран од I секвенцата под контрола на PI промоторската секвенца се врзува за O секвенцата, што ја спречува РНК полимеразата да се врзе за P секвенцата и ја инхибира иницијацијата на транскрипција; кога е присутна лактоза, lac оперонот (мета) може да биде индуциран. Во овој оперонски (мета) систем, вистинскиот индуктор не е самата лактоза. Лактозата влегува во клетката и е катализирана од β-галактозидаза за да се претвори во алолактоза. Втората, како молекула индуктор, се врзува за репресорскиот протеин и ја менува конформацијата на протеинот, што доведува до дисоцијација на репресорскиот протеин од O секвенцата и транскрипција. Изопропилтиогалактозидот (IPTG) има ист ефект како и алолактозата. Тој е многу моќен индуктор, кој не се метаболизира од бактерии и е многу стабилен, па затоа е широко користен во лабораториите.
Како да се одреди оптималната концентрација на IPTG? Земете ја E. coli како пример.
Генетски модифицираниот сој на E. coli BL21 што го содржи позитивниот рекомбинантен pGEX (CGRP/msCT) беше инокулиран во LB течен медиум што содржи 50μg·mL-1 Amp и култивиран преку ноќ на 37°C. Горенаведената култура беше инокулирана во 10 шишиња од 50mL свеж LB течен медиум што содржи 50μg·mL-1 Amp во сооднос 1:100 за експанзиона култура, и кога вредноста OD600 беше 0,6~0,8, IPTG беше додаден на конечната концентрација. Таа е 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. По индукцијата на иста температура и исто време, од него беше земен 1 mL од бактерискиот раствор, а бактериските клетки беа собрани со центрифугирање и подложени на SDS-PAGE за да се анализира влијанието на различните концентрации на IPTG врз експресијата на протеини, а потоа се одбра IPTG концентрацијата со најголема експресија на протеини.
По експериментите, ќе се открие дека концентрацијата на IPTG не е толку голема што е можно. Ова е затоа што IPTG има одредена токсичност за бактериите. Надминувањето на концентрацијата, исто така, ќе ја убие клетката; и генерално кажано, се надеваме дека колку повеќе растворлив протеин е експресиран во клетката, толку подобро, но во многу случаи кога концентрацијата на IPTG е превисока, ќе се формира голема количина на инклузија. Телото, но количината на растворлив протеин се намалува. Затоа, најсоодветната концентрација на IPTG често не е колку е поголема толку е подобра, туку колку е помала концентрацијата.
Целта на индукцијата и култивирањето на генетски модифицирани соеви е да се зголеми приносот на целниот протеин и да се намалат трошоците. Експресијата на целниот ген не е под влијание само на сопствените фактори на сојот и експресиониот плазмид, туку и на други надворешни услови, како што се концентрацијата на индуктор, температурата на индукција и времето на индукција. Затоа, генерално, пред да се експресира и прочисти непознат протеин, најдобро е да се проучат времето на индукција, температурата и концентрацијата на IPTG со цел да се изберат соодветните услови и да се добијат најдобри експериментални резултати.
Време на објавување: 31 декември 2021 година